Ανάλυση Καφεΐνης με HPLC σε Ποτά: Μέθοδος Wanyi LC3500 DAD Επικυρωμένη σύμφωνα με το GB 5009.139-2014

Η καφεΐνη είναι ένα φυσικά απαντώμενο αλκαλοειδές μεθυλοξανθίνης που βρίσκεται στους κόκκους καφέ, τα φύλλα τσαγιού και το κακάο, και είναι ένα από τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα λειτουργικά πρόσθετα και χαρακτηριστικές αρωματικές ενώσεις σε ανθρακούχα αναψυκτικά, ενεργειακά ποτά, ροφήματα τσαγιού και έτοιμα προς κατανάλωση καφέδες. Η μέτρια πρόσληψη οξύνει την εγρήγορση και ανακουφίζει την κόπωση, ωστόσο η υπερβολική ή μακροχρόνια κατανάλωση μπορεί να προκαλέσει παλμικό καρδιακό ρυθμό, αϋπνία και νευρική διέγερση, και ευαίσθητες ομάδες όπως οι έγκυες γυναίκες, τα παιδιά και τα άτομα με καρδιαγγειακές παθήσεις ανέχονται πολύ χαμηλότερες δόσεις. Τα εθνικά πρότυπα ασφάλειας τροφίμων θέτουν επομένως σαφή όρια καφεΐνης για τα ροφήματα.

Στην Κίνα, το GB 5009.139-2014, το Εθνικό Πρότυπο Ασφάλειας Τροφίμων για τον προσδιορισμό της καφεΐνης σε ροφήματα, αποτελεί τη νομοθετική βάση για την ποσοτικοποίηση της καφεΐνης σε μήτρες ροφημάτων. Η χρωματογραφία υγρών υψηλής απόδοσης (HPLC) έχει γίνει η προτιμώμενη τεχνική για σύνθετες μήτρες όπως σύνθετα ποτά, ροφήματα που περιέχουν γάλα και λειτουργικά ροφήματα βοτάνων, χάρη στην εξαιρετική της διαχωριστική ικανότητα, την ισχυρή αντοχή στην παρεμβολή της μήτρας και την εξαιρετικά ακριβή ποσοτικοποίηση.

Ένας κατασκευαστής ροφημάτων χρειαζόταν να επαληθεύσει τα επίπεδα καφεΐνης σε δύο πολύ διαφορετικές γραμμές προϊόντων: ένα ανθρακούχο ποτό τύπου κόλα και ένα προϊόν τσαγιού με γάλα. Οι δύο μήτρες απαιτούν διαφορετικές στρατηγικές προετοιμασίας: τα ανθρακούχα δείγματα πρέπει να απαερώνονται και να καθαρίζονται, ενώ τα προϊόντα που περιέχουν γάλα χρειάζονται καθίζηση πρωτεϊνών πριν την έγχυση. Και τα δύο έπρεπε να βρίσκονται άνετα εντός του εύρους βαθμονόμησης, και το χρωματογραφικό σύστημα έπρεπε να παραμένει απαλλαγμένο από συσσώρευση μήτρας σε μεγάλες ακολουθίες εγχύσεων.

Τα αντιδραστήρια περιλάμβαναν πρότυπο αναφοράς καφεΐνης, μεθανόλη βαθμού HPLC, οξείδιο του μαγνησίου, διάλυμα τριχλωροοξικού οξέος και απιονισμένο νερό.

• Διάλυμα αποθέματος (2,0 mg/mL): 20 mg πρότυπου καφεΐνης, ζυγισμένα με ακρίβεια 0,1 mg, διαλυμένα σε μεθανόλη και συμπληρωμένα στα 10 mL. αποθηκεύεται στους 4 βαθμούς C με διάρκεια ζωής έξι μηνών.
• Ενδιάμεσο διάλυμα (200 μg/mL): 5,0 mL διαλύματος αποθέματος αραιωμένα στα 50 mL με νερό. αποθηκεύεται στους 4 βαθμούς C με διάρκεια ζωής ενός μηνός.
• Διαλύματα εργασίας βαθμονόμησης: 0,5, 1,0, 2,0, 5,0 και 10,0 mL ενδιάμεσου διαλύματος αραιωμένα στα 10 mL, δίνοντας 10,0, 20,0, 40,0, 100 και 200 μg/mL. παρασκευάζονται φρέσκα την ημέρα της ανάλυσης.

Ρόφημα τύπου κόλα: απαερώστε το δείγμα σε υπερηχητικό λουτρό στους 40 βαθμούς C για 5 λεπτά. Ζυγίστε 5 g (με ακρίβεια 0,001 g), αραιώστε στα 5 mL με νερό έτσι ώστε η συγκέντρωση καφεΐνης να εμπίπτει στο εύρος βαθμονόμησης, ανακινήστε καλά, προσθέστε 0,5 g οξειδίου του μαγνησίου, ανακινήστε ξανά και αφήστε να κατακαθίσει. Φιλτράρετε το υπερκείμενο διάλυμα μέσω μεμβράνης 0,45 μm πριν την έγχυση.

Καφές και ροφήματα τσαγιού που περιέχουν γάλα: ζυγίστε 1 g (με ακρίβεια 0,001 g), αραιώστε στα 10 mL με διάλυμα τριχλωροοξικού οξέος, ανακινήστε καλά και αφήστε να σταθεί ώστε να καθιζήσουν οι πρωτεΐνες, στη συνέχεια φιλτράρετε το υπερκείμενο διάλυμα μέσω μεμβράνης 0,45 μm.

Οι κορυφές είχαν συμμετρικά σχήματα και οι μετρήσεις θεωρητικών πλακών ήταν υψηλές. Οι εγχύσεις διαλύτη κενού δεν έδειξαν παρεμβολές στον χρόνο κατακράτησης της καφεΐνης, επιβεβαιώνοντας ότι ο καθαρισμός με οξείδιο του μαγνησίου και η καθίζηση πρωτεϊνών με τριχλωροοξικό οξύ απομακρύνουν αποτελεσματικά τα συστατικά της μήτρας. Έξι διαδοχικές εγχύσεις έδειξαν σταθερό χρόνο κατακράτησης και περιοχή κορυφής, αποδεικνύοντας εξαιρετική ακρίβεια του οργάνου, ενώ η ανάκτηση άνω του 94% και στις δύο μήτρες απέδειξε ελάχιστη απώλεια δείγματος και μια στιβαρή διαδικασία προετοιμασίας.

Σύμφωνα με το GB 5009.139-2014, το σύστημα HPLC Wanyi LC3500 με ανίχνευση διόδων παρείχε μια πλήρως επικυρωμένη ροή εργασίας για τον προσδιορισμό της καφεΐνης σε ροφήματα. Η γραμμικότητα σε εύρος 10,0 έως 200,0 μg/mL με r > 0,9999, η επαναληψιμότητα κάτω από 0,3% RSD και η ανάκτηση άνω του 94% επιβεβαιώνουν ότι η μέθοδος είναι ακριβής, ακριβής και αναπαραγώγιμη τόσο για ανθρακούχα όσο και για προϊόντα που περιέχουν γάλα. Τα όρια ανίχνευσης 0,0446 mg/kg και 0,75 mg/kg δείχνουν το χαμηλό θόρυβο και την υψηλή ευαισθησία του συστήματος, καθιστώντας το κατάλληλο για τον τακτικό ποιοτικό έλεγχο, την επαλήθευση ετικετών και τις δοκιμές συμμόρφωσης με κανονισμούς στην παραγωγή ροφημάτων και σε εργαστήρια τρίτων.

• Η ανίχνευση διόδων στα 272 nm παρέχει επιλεκτική ποσοτικοποίηση χαμηλού θορύβου της καφεΐνης σε χρωματιστές και θολές μήτρες.
• Μια απλή κινητή φάση μεθανόλης και νερού σε στήλη C18 καθιστά τη μεταφορά μεθόδου μεταξύ εργαστηρίων γρήγορη και οικονομική.
• Ο καθαρισμός ειδικός για τη μήτρα, οξείδιο του μαγνησίου για ανθρακούχα ποτά και τριχλωροοξικό οξύ για ποτά με βάση το γάλα, προστατεύει τη στήλη και παρατείνει τη διάρκεια ζωής της.
• Οι σταθεροί χρόνοι κατακράτησης και οι συμμετρικές κορυφές μειώνουν την επανέγχυση και την επαναληπτική εργασία σε εργαστήρια ποιοτικού ελέγχου υψηλής απόδοσης.