Ο ανιχνευτής εξατμικής διάχυσης φωτός (ELSD) είναι ένας νέος ανιχνευτής μάζας με θεωρητική εφαρμογή σε οποιαδήποτε ένωση που μπορεί να σχηματίσει αέρια σωματίδια.Η έκδοση 2025 της φαρμακοποιίας καθορίζει τη χρήση της ανίχνευσης εκτρώσεως διασκορπισμού του φωτός (ELSD) για την ανάλυση και τον έλεγχο ποιότητας περισσότερων από 100 ποικιλιών φαρμάκων.Στην πράξη, το ELSD εφαρμόζεται συχνότερα σε ενώσεις που δεν απορροφούν υπεριώδη (UV) ρεύματα, όπως η αστραγαλοσίδη, οι υδατάνθρακες, τα αμινογλυκοσίδια και η χοληστερόλη.συχνά χρησιμεύουν ως συμπληρωματική μέθοδος ανίχνευσης σε ανιχνευτές UV και φθορισμούΩστόσο, τα αποτελέσματα ELSD επηρεάζονται από πολλούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένης της σύνθεσης της κινητής φάσης, της συγκέντρωσης οργανικού διαλύτη, του τρόπου εξώθησης και των συνθηκών nebulization.για να διασφαλίζεται η ακρίβεια και η συνέπεια των αποτελεσμάτων της ανάλυσης, είναι απαραίτητο να αξιολογηθεί η επίδραση αυτών των παραγόντων στα αποτελέσματα.
Η παρούσα μελέτη, η οποία παραπέμπει στην αναλυτική μέθοδο για το υδροχλωριούχο spectinomycin από το Μέρος II της Φαρμακοποιίας 2025 και καθοδηγείται από τις αρχές ICH QbD,χρησιμοποιήθηκε ένα ορθογώνιο πειραματικό σχέδιο για την ανίχνευση και τη βελτιστοποίηση των αναλυτικών συνθηκών.
Σχήμα 1 Υδροχλωρίνη σπεκτινομυκίνης
2Μέσο και μέθοδος
Στην παρούσα μελέτη, η χρωματογραφική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του συστήματος HPLC της σειράς LC3200 της Wayeal.διαμέρισμα στήληςΟ έλεγχος του συστήματος και η απόκτηση/επεξεργασία δεδομένων πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό χρωματογραφίας SmartLab 2.0.
Πίνακας 1 Προϋποθέσεις HPLC
| Στήλη χρωματογραφίας |
Nova Atom PC18 (4.6*250mm, 5μm) |
| Κινητή φάση |
0.1mol/l υδατικό διάλυμα τριφθοριοξικού οξέος |
| Ταχύτητα ροής (mL/min) |
0.6 |
| Θέρμανση στήλης |
35 |
| Όγκος ένεσης (μL) |
20 |
| Θέρμανση του νεφελωτήρα ELSD (°C) |
85 |
| Θέρμανση του εξατμιστήρα ELSD (°C) |
80 |
| Η θερμοκρασία ανίχνευσης ELSD (°C) |
50 |
| Δυνατότητα ροής αερίου (SLM) |
0.2 |
3Προετοιμασία διαλύματος
Λύσιμο δείγματος:Το βασικό διάλυμα υδροχλωριούχης spectinomycin παρέχθηκε από τον πελάτη με ένδειξη συγκέντρωσης 10 mg/ ml και καθαρότητα 99, 8%.
0.1Μ υδατικό διάλυμα τριφθοριοξικού οξέος:Πιπετάρετε με ακρίβεια 6,8 ml τριφθοροξυκικού οξέος σε μια 1000 ml χωρητική φιάλη, αραιώστε μέχρι το σημείο με καθαρό νερό και ανακατέψτε καλά.Φίλτρο με μεμβράνη κυτταρίνης 45μm πριν από τη χρήση.
Τυπικές λύσεις:Το βασικό διάλυμα αραιώνεται με καθαρό νερό για την παρασκευή διαλύματος δείγματος με συγκεντρώσεις 0.150, 0.250, 0.350, 0.50Κάθε διάλυμα διήθη κατόπιν μέσω ενός φίλτρου μεμβράνης κυτταρίνης μήκους 0,45 μm πριν από τη χρήση.
4Αποτελέσματα και συζήτηση
Η Κινέζικη Φαρμακοποιία χρησιμοποιεί πανομοιότυπες χρωματογραφικές συνθήκες για την ανάλυση συγγενών ουσιών και της περιεκτικότητας των κύριων συστατικών στο πλαίσιο της καταχώρισης υδροχλωριούχου σπεκτινομυκίνης.Η μέθοδος αναφέρει ότι "ο ανιχνευτής μπορεί να ρυθμιστεί με βάση τις πραγματικές συνθήκεςΚατά τη διάρκεια της μελέτης, λαμβανομένων υπόψη των οργανολογικών χαρακτηριστικών του ELSD3260, των απαιτήσεων της αναλυτικής μεθόδου και της σχετικής βιβλιογραφίας,Για την ανίχνευση πολλαπλών πειραματικών παραμέτρων χρησιμοποιήθηκε πειραματικό σχέδιο Plackett-Burman (πίνακες 2 και 3)Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκε ένα σχέδιο Box-Behnken (πίνακας 4) για τη βελτιστοποίηση της απόκρισης της περιοχής αιχμής του ανιχνευτή ELSD.
Πίνακας 2 Πειραματικό σχεδιασμό Plackett-Burman
| - Όχι, όχι, όχι. |
Δυνατότητα ροής (mL/min) |
Θερμοκρασία στήλης ((°C) |
Θέρμανση νεφελωτήρα (°C) |
Θέρμανση του εξατμιστήρα (°C) |
Θέρμανση ανίχνευσης (°C) |
Δυνατότητα ροής αερίου (SLM) |
Αποζημίωση μετά τη στήλη |
| 1 |
0.8 |
35 |
60 |
50 |
50 |
0.4 |
- Όχι, όχι. |
| 2 |
0.6 |
35 |
50 |
60 |
50 |
0.6 |
- Όχι, όχι. |
| 3 |
0.6 |
30 |
60 |
60 |
50 |
0.4 |
- Ναι, ναι. |
| 4 |
0.8 |
30 |
60 |
60 |
40 |
0.6 |
- Όχι, όχι. |
| 5 |
0.6 |
35 |
60 |
50 |
40 |
0.6 |
- Ναι, ναι. |
| 6 |
0.8 |
30 |
50 |
50 |
50 |
0.6 |
- Ναι, ναι. |
| 7 |
0.8 |
35 |
50 |
60 |
40 |
0.4 |
- Ναι, ναι. |
| 8 |
0.6 |
30 |
50 |
50 |
40 |
0.4 |
- Όχι, όχι. |
Πίνακας 3 Ανάλυση ANOVA των πειραματικών αποτελεσμάτων Plackett-Burman
| Η Πηγή της Διαφοροποίησης |
Συντελεστής |
τιμή t |
p-τιμή |
Σημασία |
| Ποσοστό ροής |
- Έξι.687 |
- Οκτώ.10 |
< 0.01 |
2 |
| Θέρμανση στήλης |
0.191 |
0.22 |
0.824 |
6 |
| Θέρμανση νεφελωτήρα (°C) |
5.342 |
6.29 |
< 0.01 |
3 |
| Θέρμανση του εξατμιστήρα (°C) |
4.135 |
4.87 |
< 0.01 |
4 |
| Θέρμανση ανίχνευσης (°C) |
0.171 |
0.21 |
0.842 |
7 |
| Δυνατότητα ροής αερίου (SLM) |
- Δέκα.381 |
- Δώδεκα.23 |
< 0.01 |
1 |
| Αποζημίωση μετά τη στήλη |
- Δύο.559 |
- Τρία.02 |
< 0.01 |
5 |
Όπως φαίνεται από τον πίνακα 3, η ροή αερίου, η ροή κινητής φάσης και η αντιστάθμιση μετά τη στήλη παρουσίασαν αρνητικές επιπτώσεις.μαζί με την απενεργοποίηση της αποζημίωσης μετά την στήληΩστόσο, η μείωση του ρυθμού ροής της κινητής φάσης μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη διεύρυνση της κορυφής και μειωμένη ευαισθησία ανίχνευσης.η ροή διατηρήθηκε σύμφωνα με τη συνήθη μέθοδοΕνώ η θερμοκρασία της στήλης και η θερμοκρασία ανίχνευσης παρουσίασαν θετικές επιδράσεις, δεν βελτίωσαν σημαντικά την τιμή απόκρισης.Οι μετέπειτα μελέτες θα επικεντρωθούν στη βελτιστοποίηση της ταχύτητας ροής του αερίου, θερμοκρασία του αναψυκτήρα και θερμοκρασία του εξατμιστήρα.
Οι επιπτώσεις της ταχύτητας ροής αερίου, της θερμοκρασίας του αναψυκτικού,και θερμοκρασία του εξατμιστήρα στην τιμή απόκρισης ερευνήθηκαν με τη χρήση ενός πειραματικού σχεδιασμού Box-Behnken στο πλαίσιο μεθοδολογίας επιφάνειας απόκρισηςΟ πειραματικός σχεδιασμός παρουσιάζεται στον πίνακα 4.
Πίνακας 4 Πειραματικό σχέδιο Box-Behnken
| - Όχι, όχι, όχι. |
Δυνατότητα ροής αερίου (SLM) |
Θέρμανση νεφελωτήρα (°C) |
Θέρμανση του εξατμιστήρα (°C) |
| 1 |
0.15 |
75 |
80 |
| 2 |
0.15 |
85 |
80 |
| 3 |
0.25 |
75 |
80 |
| 4 |
0.25 |
85 |
80 |
| 5 |
0.15 |
80 |
75 |
| 6 |
0.15 |
80 |
85 |
| 7 |
0.25 |
80 |
75 |
| 8 |
0.25 |
80 |
85 |
| 9 |
0.2 |
75 |
75 |
| 10 |
0.2 |
75 |
85 |
| 11 |
0.2 |
85 |
75 |
| 12 |
0.2 |
85 |
85 |
| 13 |
0.2 |
80 |
80 |
The detection conditions for spectinomycin hydrochloride were determined by simulating the peak area variation using response surface methodology (Figure 2) and considering the instrumental parameter ranges: θερμοκρασία nebulizers 85°C, θερμοκρασία εξατμιστήρων 80°C, θερμοκρασία ανιχνευτών 50°C και ροή αερίου 0,2 SLM.
Α. Επίδραση της ταχύτητας ροής αερίου και της θερμοκρασίας του εξατμιστήρα στην περιοχή κορυφής
Β. Επίδραση της ταχύτητας ροής αερίου και της θερμοκρασίας του αναψυκτήρα στην περιοχή κορυφής
Γ. Επίδραση της θερμοκρασίας του φυσαλυτή και της θερμοκρασίας του εξατμιστήρα στην περιοχή κορυφής
Σχήμα 2 Διακύμανση στην περιοχή των κορυφών
Ακριβότητα ένεσης
Το βασικό διάλυμα υδροχλωριούχης spectinomycin αραιώθηκε σε 0, 35 mg/ ml και πραγματοποιήθηκαν έξι διαδοχικές ενέσεις υπό τις καθορισμένες χρωματογραφικές συνθήκες με καταγραφές χρωματογραμμάτων.Υπολογίστηκαν οι σχετικές τυπικές αποκλίσεις (RSD%) του χρόνου κατακράτησης και της περιοχής κορυφής για την χρωματογραφική κορυφή της υδροχλωριούλης της σπεκτινομυκίνης.Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον πίνακα 5.
Πίνακας 5 Αποτελέσματα δοκιμών ακρίβειας ένεσης
| - Όχι, όχι, όχι. |
Χρόνος διατήρησης (min) |
Πύργος αέρας (SU*s) |
| 1 |
7.625 |
259.124 |
| 2 |
7.615 |
245.223 |
| 3 |
7.618 |
270.250 |
| 4 |
7.608 |
237.267 |
| 5 |
7.627 |
254.977 |
| 6 |
7.613 |
255.548 |
| ΔΕΔ (%) |
0.09 |
4.49 |
Ειδικότητα
Σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές ICH Q2 ((R2) για την επικύρωση των αναλυτικών διαδικασιών και τις κατευθυντήριες γραμμές για την επικύρωση των αναλυτικών μεθόδων του Γενικού Κεφαλαίου της Κινέζικης Φαρμακοποιίας, κεφάλαιο 9101η βελτιστοποιημένη μέθοδος επικυρώθηκε ως προς την ιδιαιτερότητα, γραμμικό εύρος, ακρίβεια και επαναληπτικότητα.
Το καθαρισμένο νερό και το διάλυμα δείγματος (0,35 mg/ml) αναλύθηκαν παράλληλα με τα χρωματογράμματα που καταγράφηκαν.Τα αποτελέσματα (σχήμα 3) δεν έδειξαν χρωματογραφικό ανώτατο όριο κατά τον χρόνο κατακράτησης της υδροχλωριούχης σπεκτινομυκίνης στο χρωματογράφημα καθαρού νερού.Η μέγιστη τιμή για το spectinomycin hydrochloride στο διάλυμα δείγματος επιτεύχθηκε από την αρχική γραμμή διαχωρισμού από τις παρακείμενες κορυφές (R > 1, 5).
Σχήμα 3 Αναλυτικά αποτελέσματα δείγματος υδροχλωριούλης σπεκτινομυκίνης (0, 35 mg/ ml)
Γραμμικό εύρος
Προετοιμάζονται τρία παράλληλα δείγματα από το βασικό διάλυμα υδροχλωριούλης spectinomycin σύμφωνα με τη συνήθη μέθοδο παρασκευής του διαλύματος, αναλύονται σε χρωματογραφικές συνθήκες,και καταγράφουν τα χρωματογράμματα.Πραγματοποιείται ανάλυση παλινδρόμησης με χρήση των χρωματογραφικών περιοχών κορυφής και των αντίστοιχων συγκεντρώσεων.
Σχήμα 4 Αποτελέσματα δοκιμής γραμμικότητας (μετασχηματισμένα με λογότυπο έναντι μη μετασχηματισμένων)
Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, η σχέση μεταξύ της τιμής ανταπόκρισης ELSD και της συγκέντρωσης είναι μη γραμμική,που απαιτεί λογαριθμική μετατροπή τόσο της τιμής απόκρισης όσο και της συγκέντρωσης πριν από την εκτέλεση ανάλυσης παλινδρόμησης [8].,9Μετά την εφαρμογή του λογαριθμικού μετασχηματισμού στα πειραματικά δεδομένα, ο συντελεστής συσχέτισης της γραμμικής καμπύλης παλινδρόμησης ξεπέρασε το 0.999, το οποίο είναι σημαντικά καλύτερο από το αποτέλεσμα που λαμβάνεται χωρίς λογαριθμική μετατροπή (όπως φαίνεται στο σχήμα 4).
Ακριβότητα και Επαναληψιμότητα
Το βασικό διάλυμα υδροχλωριούλης spectinomycin αραιώθηκε σε συγκεντρώσεις 0.250, 0.35Για κάθε συγκέντρωση, προετοιμάστηκαν τρία παράλληλα δείγματα, αναλύθηκαν υπό τις καθορισμένες χρωματογραφικές συνθήκες και καταγράφηκαν τα χρωματογράμματα.Το περιεχόμενο υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την καμπύλη παλινδρόμησηςΤα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον πίνακα 6.
Πίνακας 6 Αποτελέσματα δοκιμών ανάκτησης
| - Όχι, όχι, όχι. |
Πραγματική τιμή (mg/Ml) |
Υπολογισμένη τιμή (mg/Ml) |
Ανακύκλωση (%) |
Επιστροφή RSD (%) |
| 1 |
0.25 |
0.252 |
100.8 |
1.36
|
| 2 |
0.25 |
0.251 |
100.4 |
| 3 |
0.25 |
0.246 |
98.4 |
| 4 |
0.35 |
0.348 |
99.4 |
| 5 |
0.35 |
0.352 |
100.6 |
| 6 |
0.35 |
0.344 |
98.3 |
| 7 |
0.50 |
0.505 |
101.0 |
| 8 |
0.50 |
0.513 |
102.6 |
| 9 |
0.50 |
0.504 |
100.8 |
Όριο ποσοτικότητας (LOQ)
Το αρχικό διάλυμα υδροχλωριούλης στεροτομυκίνης αραιώνεται σε συγκέντρωση 12μg/ml. Το δείγμα αναλύεται σε χρωματογραφικές συνθήκες και καταγράφεται το χρωματογράφημα.Υπολογίζεται η αναλογία σήματος/θόρυβου (S/N) του χρωματογραφικού βουνού της υδροχλωρικής στερετομυκίνης και προσδιορίζεται η επαναληψιμότητά τηςΤα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον πίνακα 7.
Πίνακας 7 Αποτελέσματα δοκιμής LOQ
| - Όχι, όχι, όχι. |
ΣΕΠ |
Περιοχή κορυφής (SU*s) |
Περιοχή κορυφής RSD (%) |
| 1 |
15.647 |
3.416 |
8.45
|
| 2 |
10.634 |
2.928 |
| 3 |
15.728 |
3.145 |
| 4 |
12.842 |
3.529 |
| 5 |
14.662 |
3.396 |
| 6 |
11.076 |
3.730 |
Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι, σύμφωνα με την οδηγία ICH, η απαίτηση S/N > 10,η σχετική τυπική απόκλιση της περιοχής κορυφής για αυτή τη συγκέντρωση διαλύματος υδροχλωριούχης σπεκτινομυκίνης πληροί τα κριτήριαΩς εκ τούτου, μπορεί να χρησιμεύσει ως ποσοτικό όριο για το υδροχλωριούχο spectinomycin.
5Συμπεράσματα
Με βάση τη φαρμακοποιητική μέθοδο, η παρούσα μελέτη καθιέρωσε μια αξιόπιστη και αξιόπιστη αναλυτική διαδικασία για τον ποσοτικό προσδιορισμό της υδροχλωριώδους spectinomycin.Οι συνθήκες του ανιχνευτή εξατμιστικής διάχυσης φωτός (ELSD) βελτιστοποιήθηκαν συστηματικάΗ βελτιστοποιημένη μέθοδος απέδειξε βελτιωμένη σταθερότητα και ακρίβεια, υψηλότερη ευαισθησία ανίχνευσης και ικανοποιητικό γραμμικό εύρος.
Ο ανιχνευτής ELSD3260 είναι ένας νεοσχεδιασμένος και αναπτυγμένος ανιχνευτής χαμηλής θερμοκρασίας με διαχωρισμένη ροή.παρέχοντας μια πολύτιμη εναλλακτική λύση για τις ενώσεις που δεν απορροφούν τις ακτινοβολίες UVΣτην παρούσα μελέτη, η χρήση του ELSD3260 για την ανάλυση του υδροχλωριούχου της spectinomycin είχε ως αποτέλεσμα εξαιρετικές τιμές απόκρισης και αναπαραγωγικότητα, μαζί με αυξημένη ευαισθησία ανίχνευσης.Τα ευρήματα αυτά αποδεικνύουν ότι αυτό το όργανο είναι κατάλληλο για την ποσοτική ανάλυση του υδροχλωριούχου της spectinomycin.
Το μήνυμά σας πρέπει να αποτελείται από 20-3.000 χαρακτήρες!
