Προσδιορισμός του Υδροξυαναλόγου της Μεθειονίνης σε Ζωοτροφές με Χρωματογραφία Υγρών Υψηλής Απόδοσης (HPLC) της Wayeal

Ο υδροξυαναλόγος της μεθειονίνης (MHA) είναι ένα οργανικό οξύ πρόσθετο που χρησιμοποιείται ευρέως στη βιομηχανία ζωοτροφών ως υποκατάστατο της μεθειονίνης. Το MHA χρησιμοποιείται ευρέως στις ζωοτροφές πουλερικών (broilers και όρνιθες ωοπαραγωγής), χοίρων (χοιρίδια και χοίροι πάχυνσης), μηρυκαστικών (γαλακτοπαραγωγές αγελάδες και βοοειδή πάχυνσης) και υδατοκαλλιέργειες (ψάρια και γαρίδες). Ως υποκατάστατο της μεθειονίνης, επιδεικνύει σημαντικά αποτελέσματα στη μείωση του κόστους των ζωοτροφών, στη βελτίωση του εντερικού περιβάλλοντος των ζώων και στην ενίσχυση της ανοσίας των ζώων.

Η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης σε συνδυασμό με ανίχνευση UV είναι κατάλληλη για την ανάλυση διαφόρων σύνθετων δειγμάτων ζωοτροφών, λόγω της εξαιρετικής αποδοτικότητας διαχωρισμού, της ισχυρής αντίστασης στην παρεμβολή της μήτρας, της υψηλής ευαισθησίας ανίχνευσης και των σταθερών και αξιόπιστων ποσοτικών αποτελεσμάτων. Αυτό το πείραμα διεξήχθη σύμφωνα με το πρότυπο "Προσδιορισμός του υδροξυαναλόγου της μεθειονίνης σε ζωοτροφές με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης" (GB/T 19371-2025). Χρησιμοποιήθηκε ένας υγρός χρωματογράφος υψηλής απόδοσης της σειράς Wayeal LC3400 εξοπλισμένος με ανιχνευτή UV για την επικύρωση της διαδικασίας προετοιμασίας του δείγματος και του συστήματος υγρής χρωματογραφικής διαχωρισμού και ανίχνευσης, επιτρέποντας τόσο την ποιοτική ανίχνευση όσο και την ακριβή ποσοτική ανάλυση του υδροξυαναλόγου της μεθειονίνης σε διάφορους τύπους δειγμάτων ζωοτροφών.

Λέξεις-κλειδιά: ζωοτροφές· υδροξυαναλόγος μεθειονίνης· υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης.

1. Όργανα και αντιδραστήρια

1.1 Λίστα διαμόρφωσης HPLC

Πίνακας 1 Λίστα διαμόρφωσης συστήματος υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης

1.2 Λίστα αντιδραστηρίων και πρότυπων αναφοράς

Πίνακας 2 Λίστα αντιδραστηρίων και πρότυπων αναφοράς

1.3 Συνθήκες υγρής χρωματογραφίας

Πίνακας 3 Συνθήκες υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης

1.4 Πειραματικά υλικά και βοηθητικός εξοπλισμός

Υπερηχητικός καθαριστής·

Αναδευτήρας Vortex·

Φυγόκεντρος υψηλής ταχύτητας·

Αναλυτικός ζυγός·

Αναδευτήρας.

2. Μέθοδος πειράματος

2.1 Προετοιμασία διαλυμάτων

2.1.1 Διαλύματα πρότυπης καμπύλης:

Ζυγίστε με ακρίβεια μια κατάλληλη ποσότητα πρότυπου αναφοράς υδροξυαναλόγου μεθειονίνης και διαλύστε το σε 10% ακετονιτρίλιο για να παρασκευάσετε μια σειρά πρότυπων διαλυμάτων σε μαζικές συγκεντρώσεις 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0, 20.0, 40.0 και 80.0μg/mL. Μεταφέρετε με ακρίβεια 5mL από κάθε πρότυπο διάλυμα σε δοκιμαστικούς σωλήνες με πώμα 15mL ξεχωριστά. Προσθέστε με ακρίβεια 0.1mL διαλύματος υδροξειδίου του καλίου 50% και αναδεύστε για 15 δευτερόλεπτα. Στη συνέχεια, προσθέστε με ακρίβεια 0.2mL διαλύματος φωσφορικού οξέος 50% και αναδεύστε για άλλα 15 δευτερόλεπτα. Φυγοκεντρήστε σε 8000r/min για 5 λεπτά. Διηθήστε το υπερκείμενο υγρό μέσω φίλτρου μικροπορωδών μεμβρανών πριν την ανάλυση.

2.1.2 Διαλύματα δειγμάτων προς ανάλυση:

Ζυγίστε 5g δείγματος ζωοτροφής σε ένα δοχείο, προσθέστε 50mL διαλύματος ακετονιτριλίου 10% και αναδεύστε για 30 δευτερόλεπτα. Τοποθετήστε σε αναδευτήρα και αναδεύστε για 30 λεπτά. Φυγοκεντρήστε σε 8000r/min για 5 λεπτά και κρατήστε το υπερκείμενο υγρό για μελλοντική χρήση. Μεταφέρετε με ακρίβεια 5mL του παραπάνω υπερκείμενου υγρού σε δοκιμαστικό σωλήνα με πώμα 15mL. Προσθέστε με ακρίβεια 0.1mL διαλύματος υδροξειδίου του καλίου 50% και αναδεύστε για 15 δευτερόλεπτα. Στη συνέχεια, προσθέστε με ακρίβεια 0.2mL διαλύματος φωσφορικού οξέος 50% και αναδεύστε για άλλα 15 δευτερόλεπτα. Φυγοκεντρήστε σε 8000r/min για 5 λεπτά. Διηθήστε το υπερκείμενο υγρό μέσω φίλτρου μικροπορωδών μεμβρανών πριν την ανάλυση. Προετοιμάστε δύο παράλληλα διαλύματα δειγμάτων προς ανάλυση.

2.1.3 Διαλύματα δοκιμής ανάκτησης:

Μεταφέρετε με ακρίβεια 2.5mL του υπερκείμενου υγρού του δείγματος και 2.5mL από κάθε πρότυπο διάλυμα σε δοκιμαστικό σωλήνα με πώμα 15mL. Προσθέστε με ακρίβεια 0.1mL διαλύματος υδροξειδίου του καλίου 50% και αναδεύστε για 15 δευτερόλεπτα. Στη συνέχεια, προσθέστε με ακρίβεια 0.2mL διαλύματος φωσφορικού οξέος 50% και αναδεύστε για άλλα 15 δευτερόλεπτα. Φυγοκεντρήστε σε 8000r/min για 5 λεπτά. Διηθήστε το υπερκείμενο υγρό μέσω φίλτρου μικροπορωδών μεμβρανών πριν την ανάλυση.

3. Αποτέλεσμα πειράματος

3.1 Γραμμικότητα και εύρος

Πίνακας 4 Πίνακας συγκεντρώσεων πρότυπης καμπύλης

Σχήμα 1 Πρότυπη καμπύλη υδροξυαναλόγου μεθειονίνης

Σημείωση: Λήφθηκαν κατάλληλες ποσότητες διαλύματος πρότυπου αναφοράς υδροξυαναλόγου μεθειονίνης και αραιώθηκαν σειριακά σε μια σειρά συγκεντρώσεων για την παρασκευή της πρότυπης καμπύλης. Το γραμμικό εύρος ήταν 0.5–80.0 μg/mL, και ο συντελεστής συσχέτισης (R) ήταν 0.99983, υποδεικνύοντας εξαιρετική γραμμικότητα για τον αναλυόμενο.

3.2 Ακρίβεια

Σχήμα 2 Επικαλυπτόμενα χρωματογράμματα δοκιμής ακρίβειας για πρότυπο αναφοράς (20.0μg/mL)

Πίνακας 5 Δεδομένα δοκιμής ακρίβειας για πρότυπο αναφοράς (20.0μg/mL)

Σημείωση: Το πρότυπο αναφοράς υδροξυαναλόγου μεθειονίνης (σε συγκέντρωση 20.0μg/mL) εγχύθηκε συνεχώς για 6 επαναλήψεις. Η επαναληψιμότητα (RSD) του χρόνου κατακράτησης ήταν 0.084%, και αυτή του εμβαδού κορυφής ήταν 0.391%, υποδεικνύοντας καλή ακρίβεια του οργάνου.

3.3 Ανάκτηση

Σχήμα 3 Επικαλυπτόμενα χρωματογράμματα δοκιμής ανάκτησης υδροξυαναλόγου μεθειονίνης σε ζωοτροφές

Πίνακας 6 Δεδομένα δοκιμής ανάκτησης υδροξυαναλόγου μεθειονίνης σε ζωοτροφές

Σημείωση: Το δείγμα προστέθηκε με πρότυπο αναφοράς σε συγκέντρωση 40.0μg/mL και αναλύθηκε σύμφωνα με την παραπάνω διαδικασία. Η ανάκτηση που επιτεύχθηκε ήταν 88.56%, υποδεικνύοντας καλή ακρίβεια της μεθόδου.

3.4 Όριο ανίχνευσης (LOD)

Σχήμα 4 Χρωματογράφημα πρότυπου υδροξυαναλόγου μεθειονίνης (2.5μg/mL)

Πίνακας 7 Δεδομένα δοκιμής για πρότυπο αναφοράς υδροξυαναλόγου μεθειονίνης (2.5μg/mL)

Σημείωση: Με βάση τα δεδομένα δοκιμής του πρότυπου αναφοράς υδροξυαναλόγου μεθειονίνης στα 2.5μg/mL όπως φαίνεται στον παραπάνω πίνακα, το θεωρητικό όριο ανίχνευσης (LOD) υπολογίστηκε σε 0.033μg/mL με λόγο σήματος προς θόρυβο 3 (S/N = 3).

3.5 Δοκιμή δείγματος ζωοτροφής

Σχήμα 5 Χρωματογράφημα δείγματος ζωοτροφής

Σημείωση: Ο υδροξυαναλόγος μεθειονίνης ανιχνεύθηκε σε δείγμα ζωοτροφής σε συγκέντρωση 0.402μg/mL.

4. Συμπέρασμα

Αυτό το πείραμα διεξήχθη σύμφωνα με το πρότυπο "Προσδιορισμός του υδροξυαναλόγου της μεθειονίνης σε ζωοτροφές με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης" (GB/T 19371-2025), χρησιμοποιώντας τον υγρό χρωματογράφο υψηλής απόδοσης της σειράς Wayeal LC3400 εξοπλισμένο με ανιχνευτή UV. Τα πειραματικά αποτελέσματα έδειξαν ότι η κορυφή-στόχος παρουσίασε καλή συμμετρία και υψηλό αριθμό θεωρητικών πλακών. Στο εύρος συγκεντρώσεων 0.5–80.0μg/mL, ο συντελεστής συσχέτισης (R) ήταν πάνω από 0.9998. Οι τιμές RSD για τον χρόνο κατακράτησης και το εμβαδόν κορυφής του πρότυπου αναφοράς MHA (20.0μg/mL) ήταν 0.084% και 0.391%, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας εξαιρετική ακρίβεια του οργάνου. Η ανάκτηση MHA σε δείγματα ζωοτροφών με προσθήκη 40.0μg/mL ήταν 88.56%, αποδεικνύοντας καλή ακρίβεια της μεθόδου. Το θεωρητικό όριο ανίχνευσης (LOD) για το MHA προσδιορίστηκε σε 0.033μg/mL. Το MHA ανιχνεύθηκε επιτυχώς σε δείγμα ζωοτροφής σε συγκέντρωση 0.402μg/mL. Όλα τα παραπάνω δεδομένα πληρούν τις απαιτήσεις της φαρμακοποιίας για την απόδοση του οργάνου.