Προσδιορισμός καταλοίπων Ερυθρομυκίνης σε υπολείμματα ζύμωσης αντιβιοτικών με τη χρήση του συστήματος υγρής χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας Wayeal LCMS-TQ9200

Η ερυθρομυκίνη είναι ένα μακρολιδικό αντιβιοτικό που παράγεται με ζύμωση του Streptomyces erythreus. Ασκεί την αντιβακτηριακή του δράση κυρίως αναστέλλοντας τη βακτηριακή σύνθεση πρωτεϊνών. Η παραγωγή ερυθρομυκίνης βασίζεται κυρίως στην τεχνολογία βιο-ζύμωσης, η οποία περιλαμβάνει βήματα όπως η επιλογή στελέχους, η καλλιέργεια σπόρων, η μεγάλης κλίμακας ζύμωση σε δεξαμενές, η εκχύλιση και ο καθαρισμός. Μετά τη ζύμωση, η ερυθρομυκίνη εκχυλίζεται με οργανικούς διαλύτες (όπως ο οξικός βουτυλεστέρας), ακολουθούμενη από καθαρισμό μέσω κρυστάλλωσης ή διαχωρισμού με ρητίνη ανταλλαγής ιόντων, αποδίδοντας τελικά άλατα κλινικής ποιότητας (π.χ. αιθυλοηλεκτρική ερυθρομυκίνη). Ωστόσο, η διαδικασία παραγωγής ερυθρομυκίνης δημιουργεί σημαντική ποσότητα υπολειμμάτων μυκηλιακών (υπολείμματα ζύμωσης), τα οποία μπορεί να περιέχουν υπολειμματικά αντιβιοτικά, μικροβιακές πρωτεΐνες και μεταβολικά υποπροϊόντα. Εάν δεν διαχειριστούν σωστά, αυτά τα υπολείμματα μπορεί να εισέλθουν στην οικολογική αλυσίδα μέσω περιβαλλοντικής απόρριψης ή χρήσης ως πρόσθετα ζωοτροφών, οδηγώντας σε πολλαπλούς κινδύνους: Η υπολειμματική ερυθρομυκίνη μπορεί να προωθήσει την εξάπλωση γονιδίων αντοχής στα αντιβιοτικά στο έδαφος και τα υδάτινα σώματα, διαταράσσοντας την ισορροπία της μικροβιακής κοινότητας. ενισχυμένη μέσω της τροφικής αλυσίδας, μπορεί να προκαλέσει την εμφάνιση ανθεκτικών βακτηριακών στελεχών σε ζώα ή ανθρώπους, υπονομεύοντας την αποτελεσματικότητα των αντιβιοτικών. επιπλέον, η ανεπαρκώς χρησιμοποιημένη οργανική ύλη εντός των υπολειμμάτων μπορεί να προκαλέσει περιβαλλοντική ρύπανση. Επομένως, η αυστηρή ρύθμιση των μυκηλιακών υπολειμμάτων είναι ένα κρίσιμο μέτρο για τον έλεγχο της ρύπανσης από την παραγωγή ερυθρομυκίνης.

Αυτό το πείραμα διεξήχθη με αναφορά στο πρότυπο "T/PIAC 00003—2021 Group Standard of China Pharmaceutical Industry Association - Method for the determination of erythromycin in antibiotic residue, organic fertilizer base materials, crops, and environmental media," χρησιμοποιώντας το σύστημα φασματομετρίας μάζας χρωματογραφίας υγρών Wayeal LCMS-TQ9200 για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε ερυθρομυκίνη στα μυκηλιακά υπολείμματα. Τα πειραματικά αποτελέσματα δείχνουν ότι η δοκιμή καταλληλότητας του συστήματος έδειξε καλό σχήμα κορυφής και καλή γραμμικότητα, πληρώντας τις πειραματικές απαιτήσεις.

1. Όργανα και Αντιδραστήρια

1.1 Λίστα διαμόρφωσης LCMS

Πίνακας 1 Λίστα διαμόρφωσης οργάνων

1.2 Αντιδραστήρια και Πρότυπα

Πίνακας 2 Λίστα αντιδραστηρίων και προτύπων

1.3 Πειραματικό υλικό και βοηθητικός εξοπλισμός

Υπερηχητικό καθαριστικό

Αναμίκτης Vortex

Υψηλής ταχύτητας φυγοκεντρητής

2. Μέθοδος πειράματος

2.1 Προεπεξεργασία δείγματος

Ζυγίστε 0,5 g του δείγματος (με ακρίβεια 0,001 g) σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα με γυάλινο πώμα. Προσθέστε 50 mL ακετονιτριλίου, αναδεύστε με vortex για 1 λεπτό για να ομογενοποιήσετε το μείγμα και πραγματοποιήστε εκχύλιση με υπερήχους για 20 λεπτά. Στη συνέχεια, μεταφέρετε το μείγμα σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης 50 mL και φυγοκεντρήστε στα 4000 rpm για 10 λεπτά. Συλλέξτε μια κατάλληλη ποσότητα υπερκείμενου και περάστε το μέσω μιας μεμβράνης φίλτρου 0,22μm. Απορρίψτε τουλάχιστον 1 mL του αρχικού διηθήματος και, στη συνέχεια, μεταφέρετε το υπόλοιπο διήθημα σε ένα φιαλίδιο LC κεχριμπαριού για ανάλυση.

2.2 Συνθήκες πειράματος

2.2.1 Συνθήκες μεθόδου υγρής χρωματογραφίας

Στήλη χρωματογραφίας: C18 1.7μm 2.1x50mm

Κινητή φάση: Α: Ακετονιτρίλιο, Β: 0,1% Μυρμηκικό οξύ σε νερό

Ροή: 0,3 mL/min

Θερμοκρασία στήλης: 30℃

Όγκος έγχυσης: 2μL

2.2.2 Συνθήκες μεθόδου φασματόμετρου μάζας

Πίνακας 3 Παράμετροι πηγής ιόντων φασματομετρίας μάζας

3. Αποτέλεσμα πειράματος

3.1 Δοκιμή καταλληλότητας συστήματος

Τα αποτελέσματα της δοκιμής καταλληλότητας του συστήματος έδειξαν καλά καθορισμένες κορυφές στόχου χωρίς παρεμβολές από εξωτερικές κορυφές, πληρώντας όλες τις πειραματικές απαιτήσεις.

Εικ. 1 Χρωματογράφημα του τυπικού διαλύματος εργασίας ερυθρομυκίνης Α (0,5 ng/mL)

3.2 Γραμμική περιοχή

Η καμπύλη βαθμονόμησης για την ερυθρομυκίνη Α παρασκευάστηκε με διαδοχική αραίωση του τυπικού διαλύματος χρησιμοποιώντας διαλύματα εργασίας ενδιάμεσης συγκέντρωσης. Η καμπύλη έδειξε εξαιρετική γραμμικότητα σε όλη την περιοχή των 0,5-500 ng/mL, με συντελεστή συσχέτισης (R²) μεγαλύτερο από 0,99.

Πίνακας 4 Γραμμική περιοχή της ερυθρομυκίνης Α

Εικ. 2 Καμπύλη βαθμονόμησης για την ερυθρομυκίνη Α

3.3 Όριο ανίχνευσης (LOD) και όριο ποσοτικοποίησης (LOQ)

Σε αυτή τη μέθοδο, το όριο ανίχνευσης (LOD) και το όριο ποσοτικοποίησης (LOQ) για το τυπικό διάλυμα ερυθρομυκίνης Α προσδιορίστηκαν σε 0,2 ng/mL και 0,5 ng/mL, αντίστοιχα. Οι αντίστοιχες αναλογίες σήματος προς θόρυβο (S/N) ήταν 110,02 και 292,20, υπερβαίνοντας σημαντικά τις ελάχιστες απαιτήσεις των 3 και 10, πληρώντας έτσι τα πειραματικά κριτήρια ευαισθησίας.

Εικόνα 3. Εξαγόμενα χρωματογραφήματα ιόντων για το LOD και το LOQ της ερυθρομυκίνης Α

3.4 Δοκιμή ακρίβειας

Το διάλυμα ερυθρομυκίνης Α εγχύθηκε διαδοχικά επτά φορές, με τα αποτελέσματα να εμφανίζονται στο παρακάτω σχήμα. Η απόκλιση χρόνου κατακράτησης για την ερυθρομυκίνη Α ήταν 0,19% και η απόκλιση της περιοχής κορυφής ήταν 0,96%, και οι δύο είναι κάτω από 5%, πληρώντας τις πειραματικές απαιτήσεις.

Εικόνα 4. Χρωματογραφήματα ακρίβειας του δείγματος ερυθρομυκίνης Α (7 εγχύσεις)

3.5 Δοκιμή δείγματος

Ακολουθώντας την προαναφερθείσα μέθοδο προεπεξεργασίας, η περιοχή κορυφής στόχου στο στερεό δείγμα ήταν 7,4E6. Υπολογίστηκε μέσω της μεθόδου εξωτερικού προτύπου, η περιεκτικότητα σε ερυθρομυκίνη Α στο διάλυμα του δείγματος προσδιορίστηκε σε 400 ng/mL.

Εικ. 5 Χρωματογράφημα της δοκιμής δείγματος ερυθρομυκίνης Α

4. Συμπέρασμα

Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί το σύστημα φασματομετρίας μάζας χρωματογραφίας υγρών Wayeal LCMS-TQ9200 για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε ερυθρομυκίνη Α στα υπολείμματα ζύμωσης αντιβιοτικών. Τα δεδομένα δείχνουν ότι η μέθοδος επιδεικνύει εξαιρετική απόδοση: όλες οι χρωματογραφικές κορυφές παρουσιάζουν βέλτιστο σχήμα χωρίς ουρά και η ευαισθησία πληροί τις πειραματικές απαιτήσεις. Ο συντελεστής γραμμικής συσχέτισης (R²) υπερβαίνει το 0,99. Οι αποκλίσεις χρόνου κατακράτησης και περιοχής κορυφής για όλες τις ενώσεις σε επτά διαδοχικές εγχύσεις είναι εντός 1%, υποδεικνύοντας υψηλή ακρίβεια. Τα χρωματογραφήματα του δείγματος δεν δείχνουν παρεμβολές από εξωτερικές κορυφές και η μετρημένη περιεκτικότητα του δείγματος είναι 400 ng/mL. Αυτή η μέθοδος, εξοπλισμένη με το σύστημα Wayeal LC-MS/MS, πληροί τις απαιτήσεις για τη συνήθη ποιοτική και ποσοτική ανάλυση των δειγμάτων δοκιμής.