Προσδιορισμός καταλοίπων αντιβιοτικών αμφενικόλης σε κρέας κοτόπουλου με LCMS-TQ9200 Wayeal

Λέξεις κλειδιά: LCMS, αμφενικόλη, ασφάλεια τροφίμων, υπολείμματα κτηνιατρικών φαρμάκων.

1. Όργανα και Αντιδραστήρια

1.1 Λίστα Διαμόρφωσης LCMS

Πίνακας 1 Λίστα Διαμόρφωσης Οργάνων

1.3 Πειραματικά Υλικά και Βοηθητικός Εξοπλισμός

Υπερηχητικό καθαριστικό

Αναμίκτης Vortex

Εξατμιστής αζώτου λουτρού νερού

Υψηλής ταχύτητας φυγοκεντρητής

2. Μέθοδοι Πειράματος

2.1 Παρασκευή Διαλύματος

2.1.1 Διάλυμα οξικού αιθυλεστέρα 2% με αμμωνία: Πάρτε 4mL διαλύματος αμμωνίας και αραιώστε το σε 200mL με οξικό αιθυλεστέρα.

2.1.2 Διάλυμα χλωριούχου νατρίου 4%: Πάρτε 4g χλωριούχου νατρίου, διαλύστε το σε νερό και αραιώστε το σε 100mL.

2.1.3 Διάλυμα n-Εξανίου κορεσμένο με χλωριούχο νάτριο 4%: Πάρτε μια κατάλληλη ποσότητα διαλύματος χλωριούχου νατρίου 4%, προσθέστε περίσσεια n-εξανίου, ανακατέψτε, αφήστε να σταθεί για διαχωρισμό στρώσεων και πάρτε το ανώτερο στρώμα n-εξανίου.

2.1.4 Μικτό πρότυπο διάλυμα εργασίας: Πάρτε μια κατάλληλη ποσότητα του μικτού πρότυπου διαλύματος αποθέματος, αραιώστε με μεθανόλη 20% για να επιτύχετε χλωραμφενικόλη-D5 στα 10ng/mL και άλλα εσωτερικά πρότυπα (φλορφενικόλη-D3, θειαμφενικόλη-D3 και φλορφενικόλη αμίνη-D3) στα 50ng/mL το καθένα.

2.2 Προεπεξεργασία Δείγματος

2.2.1 Εκχύλιση Δείγματος: Ζυγίστε 2g δείγματος (με ακρίβεια ±0,01g), προσθέστε 100µL μικτού εσωτερικού πρότυπου διαλύματος εργασίας, αναδεύστε σε vortex για 1 λεπτό, προσθέστε 10mL διαλύματος οξικού αιθυλεστέρα 2% με αμμωνία, αναδεύστε σε vortex για 10 λεπτά, φυγοκεντρήστε στα 8000rpm για 5 λεπτά και συλλέξτε το υπερκείμενο. Προσθέστε άλλα 10mL διαλύματος οξικού αιθυλεστέρα 2% με αμμωνία στο υπόλειμμα και επαναλάβετε τη διαδικασία εκχύλισης. Συνδυάστε τα δύο υπερκείμενα, εξατμίστε μέχρι να στεγνώσουν υπό ροή αζώτου στους 50°C και κρατήστε τα για χρήση.

2.2.2 Καθαρισμός Δείγματος: Προσθέστε 3mL διαλύματος χλωριούχου νατρίου 4% στο υπόλειμμα καθαρισμού, αναδεύστε σε vortex για να διαλυθεί, στη συνέχεια προσθέστε 5mL διαλύματος n-εξανίου κορεσμένου με χλωριούχο νάτριο 4%, αναδεύστε σε vortex για 30 δευτερόλεπτα, φυγοκεντρήστε στα 8000 rpm για 5 λεπτά και απορρίψτε το ανώτερο στρώμα n-εξανίου. Επαναλάβετε τη διαδικασία απολίπανσης μία φορά. Προσθέστε 5mL διαλύματος οξικού αιθυλεστέρα 2% με αμμωνία, αναδεύστε σε vortex για 10 λεπτά, φυγοκεντρήστε στα 8000 rpm για 5 λεπτά και συλλέξτε το υπερκείμενο. Προσθέστε άλλα 5mL διαλύματος οξικού αιθυλεστέρα 2% με αμμωνία στο υπόλειμμα και επαναλάβετε τη διαδικασία εκχύλισης. Συνδυάστε τα υπερκείμενα, εξατμίστε μέχρι να στεγνώσουν υπό ροή αζώτου στους 50°C, προσθέστε 1mL διαλύματος μεθανόλης 20%, αναδεύστε σε vortex για 30 δευτερόλεπτα, φιλτράρετε μέσω μεμβράνης και περιμένετε για οργανολογική ανάλυση.

2.3 Συνθήκες Πειράματος

2.3.1 Συνθήκες Υγρής Χρωματογραφίας

Χρωματογραφική στήλη: C18 1.7μm 2.1x50mm

Κινητή φάση: A: Ακετονιτρίλιο; B: 2 mM Μορφικό Αμμώνιο σε Νερό

Ροή: 0.3mL/min

Θερμοκρασία στήλης: 40 ℃

Όγκος έγχυσης: 5µL

2.3.2 Συνθήκες Φασματομετρίας Μάζας

Πίνακας 3 Παράμετροι Πηγής Ιόντων

3. Αποτέλεσμα Πειράματος

3.1 Πρότυπο Χρωματογράφημα

Ο προσδιορισμός τεσσάρων αντιβιοτικών αμιδίου και των εσωτερικών τους προτύπων ολοκληρώθηκε εντός 6 λεπτών. Όλες οι κορυφές έδειξαν καλά σχήματα κορυφών χωρίς ουρά και κάθε ένωση έδειξε ικανοποιητική απόκριση, πληρώντας τις πειραματικές απαιτήσεις.

Εικ. 1 Χρωματογράφημα 4 Αντιβιοτικών Αμφενικόλης και Εσωτερικού Προτύπου (Χλωραμφενικόλη 0.2ng/mL, Άλλα Αντιβιοτικά 1ng/mL)

3.2 Γραμμικό Εύρος

Πάρτε μια κατάλληλη ποσότητα του μικτού πρότυπου διαλύματος αλκοόλης αμιδίου και αραιώστε το σταδιακά σε μια σειρά συγκεντρώσεων για να προετοιμάσετε μια τυπική καμπύλη. Η μέθοδος εσωτερικού προτύπου ισοτόπων χρησιμοποιήθηκε για ποσοτική ανάλυση. Το γραμμικό εύρος ήταν 0.2-10 ng/mL για τη χλωραμφενικόλη και 1-50 ng/mL για την αμίνη φλορφενικόλης, τη θειαμφενικόλη και τη φλορφενικόλη. Η απόκλιση μεταξύ των γραμμικών αποτελεσμάτων ανίχνευσης και των γνωστών συγκεντρώσεων ήταν μικρότερη από τη μέγιστη επιτρεπόμενη απόκλιση, με τιμές R² που κυμαίνονται από 0.9958 έως 0.9998, υποδεικνύοντας εξαιρετική γραμμικότητα για όλα τα συστατικά.

Πίνακας 4 Γραμμικό Εύρος Ενώσεων

Εικ. 2 Δεδομένα Καμπύλης Βαθμονόμησης των Τεσσάρων Ενώσεων

3.3 LOD και LOQ

Το Κινεζικό Εθνικό Πρότυπο Ασφάλειας Τροφίμων GB 31658.20-2022 ορίζει ότι για αυτή τη μέθοδο, το όριο ανίχνευσης (LOD) για τη χλωραμφενικόλη είναι 0.1µg/kg και το όριο ποσοτικοποίησης (LOQ) είναι 0.2µg/kg; ενώ για τη θειαμφενικόλη, τη φλορφενικόλη και την αμίνη φλορφενικόλης, το LOD είναι 0.5µg/kg και το LOQ είναι 1 µg/kg. Οι λόγοι σήματος προς θόρυβο για όλες τις στοχευόμενες ενώσεις στις καθορισμένες συγκεντρώσεις του ορίου ανίχνευσης (LOD) και του ορίου ποσοτικοποίησης (LOQ) είναι σημαντικά μεγαλύτεροι από 3 και 10, γεγονός που συμμορφώνεται με τις απαιτήσεις ευαισθησίας που καθορίζονται στο εθνικό πρότυπο.

Πίνακας 5 Όρια Ανίχνευσης και Ποσοτικοποίησης για Κάθε Ένωση

Εικ. 3 Χρωματογραφήματα Ορίων Ανίχνευσης και Ορίων Ποσοτικοποίησης για Τέσσερις Ενώσεις

3.4 Δοκιμή Ακρίβειας

Πάρτε χαμηλές, μεσαίες και υψηλές συγκεντρώσεις μικτών πρότυπων διαλυμάτων αμφενικόλης και πραγματοποιήστε έξι συνεχόμενες εγχύσεις για να συγκρίνετε τις αποκλίσεις στον χρόνο κατακράτησης και την περιοχή κορυφής. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον παρακάτω πίνακα. Οι αποκλίσεις χρόνου κατακράτησης όλων των ενώσεων αμφενικόλης ήταν μικρότερες από 1% και οι αποκλίσεις περιοχής κορυφής ήταν μικρότερες από 5%, πληρώντας την απαίτηση ακρίβειας του RSD ≤ 15% που καθορίζεται από το εθνικό πρότυπο.

Πίνακας 6 Δοκιμή Ακρίβειας για Κάθε Ένωση

Εικ. 4 Χρωματογραφήματα Ακρίβειας Τεσσάρων Ενώσεων Αλκοόλης Αμιδίου

3.5 Δοκιμή Ανάκτησης Προσθήκης Μήτρας

Η ακρίβεια αυτής της μεθόδου ανίχνευσης αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μια δοκιμή ανάκτησης προσθήκης. Προσθέστε γνωστές συγκεντρώσεις πρότυπων δειγμάτων στο κενό δείγμα μήτρας σε διαφορετικές αναλογίες για προεπεξεργασία, προετοιμάζοντας δείγματα με προσθήκη μήτρας σε υψηλές, μεσαίες και χαμηλές συγκεντρώσεις. Κάθε επίπεδο συγκέντρωσης των δειγμάτων με προσθήκη αναλύθηκε ανεξάρτητα έξι φορές. Ο ρυθμός ανάκτησης υπολογίστηκε συγκρίνοντας τη συγκέντρωση που ανιχνεύθηκε στη μήτρα πριν και μετά την προσθήκη, αξιολογώντας έτσι την ακρίβεια της μεθόδου. Τα αποτελέσματα φαίνονται ως εξής: στη μήτρα κοτόπουλου, οι ρυθμοί ανάκτησης προσθήκης όλων των ενώσεων κυμάνθηκαν από 94.5% έως 107.2%, με CV εντός 5%, υποδεικνύοντας ότι η ακρίβεια πληροί τις απαιτήσεις της μεθόδου.

Πίνακας 6 Ρυθμοί Ανάκτησης Ενώσεων σε Μήτρα Κοτόπουλου με Προσθήκη

3.6 Δοκιμή Δείγματος

Δείγματα στήθους κοτόπουλου που αγοράστηκαν τυχαία από σούπερ μάρκετ εκχυλίστηκαν και καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας την προαναφερθείσα μέθοδο προεπεξεργασίας δείγματος. Μετά την εξέταση των δειγμάτων στο όργανο, δεν ανιχνεύθηκε καμία από τις τέσσερις αμιδικές αντιβιοτικές ουσίες.

Εικ. 5 Χρωματογράφημα Τεσσάρων Ενώσεων Αλκοόλης Αμιδίου σε Δείγματα Στήθους Κοτόπουλου Σούπερ Μάρκετ

4. Συμπέρασμα

Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί το σύστημα φασματομετρίας μάζας υγρής χρωματογραφίας Wayeal LCMS-TQ9200 για τον προσδιορισμό αντιβιοτικών αμφενικόλης σε τρόφιμα ζωικής προέλευσης, επιτρέποντας την ταυτόχρονη απόκτηση ενώσεων τόσο σε θετικούς όσο και σε αρνητικούς ιοντικούς τρόπους. Τα δεδομένα δείχνουν ότι η μέθοδος παρέχει καλά σχηματισμένες χρωματογραφικές κορυφές χωρίς ουρά και η ευαισθησία της πληροί τις απαιτήσεις του εθνικού προτύπου. Οι συντελεστές γραμμικής συσχέτισης είναι όλοι μεγαλύτεροι από 0.99. Η απόκλιση χρόνου κατακράτησης για όλες τις ενώσεις σε έξι συνεχόμενες εγχύσεις είναι εντός 1% και η απόκλιση περιοχής κορυφής είναι εντός 5%, αποδεικνύοντας καλή ακρίβεια. Οι ρυθμοί ανάκτησης προσθήκης στη μήτρα κοτόπουλου κυμαίνονται από 94.5% έως 107.2%, με CV εντός 5%, υποδεικνύοντας ότι η ακρίβεια πληροί τις μεθοδολογικές απαιτήσεις. Αναλύθηκαν δείγματα στήθους κοτόπουλου που αγοράστηκαν τυχαία από σούπερ μάρκετ και δεν ανιχνεύθηκε καμία από τις τέσσερις αντιβιοτικές ουσίες αμφενικόλης. Αυτό αποδεικνύει ότι η μέθοδος, εξοπλισμένη με το σύστημα φασματομετρίας μάζας υγρής χρωματογραφίας της Wayeal, πληροί τις απαιτήσεις για τη συνήθη ποιοτική και ποσοτική ανίχνευση των στοχευόμενων δειγμάτων.