Καθορισμός υπολειμμάτων β-αγωνιστών στο χοιρινό με τη χρήση του Wayeal LCMS-TQ9200 συστήματος υγρής χρωματογραφίας-ταντέμ μαζικής φασματομετρίας

Αυτό το πείραμα αναφέρεται στο "GB 31658.22-2022 Εθνικό Πρότυπο Ασφάλειας Τροφίμων — Προσδιορισμός καταλοίπων β-αγωνιστών σε τρόφιμα ζωικής προέλευσης με υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας ταντέμ" και χρησιμοποιεί το σύστημα υγρής χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας ταντέμ Wayeal LCMS-TQ9200 για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε β-αγωνιστές στο χοιρινό κρέας. Τα πειραματικά αποτελέσματα δείχνουν ότι η δοκιμή καταλληλότητας του συστήματος έδειξε καλοσχηματισμένες κορυφές και καλή γραμμικότητα, ικανοποιώντας τις πειραματικές απαιτήσεις. Η επαναληψιμότητα του χρόνου κατακράτησης για το πρότυπο διάλυμα εργασίας β-αγωνιστών ήταν κάτω από 1%, και η επαναληψιμότητα της περιοχής της κορυφής ήταν μικρότερη από 3%, υποδεικνύοντας καλή επαναληψιμότητα. Για το διάλυμα δοκιμής ευαισθησίας των β-αγωνιστών, οι λόγοι σήματος προς θόρυβο των κύριων κορυφών σε συγκεντρώσεις 0,2 ng/mL και 0,5 ng/mL ήταν σημαντικά μεγαλύτεροι από 3 και 10, αντίστοιχα, ικανοποιώντας τις πειραματικές απαιτήσεις.

Δεν ανιχνεύθηκαν β-αγωνιστές στο δείγμα χοιρινού κρέατος. Όλα τα παραπάνω δεδομένα πληρούν τις απαιτήσεις των οργάνων που καθορίζονται από τη μέθοδο του προτύπου.

Λέξεις κλειδιά: Υγρή Χρωματογραφία-Φασματομετρία Μάζας Ταντέμ; β-Αγωνιστές; Κλενβουτερόλη; Ασφάλεια Τροφίμων.

1. Όργανα και Αντιδραστήρια

1.1 Λίστα διαμόρφωσης LCMS

Πίνακας 1 Λίστα διαμόρφωσης οργάνων

1.2 Αντιδραστήρια και Πρότυπα

Πίνακας 2 Λίστα αντιδραστηρίων και προτύπων

1.3 Πειραματικό υλικό και βοηθητικός εξοπλισμός

Υπερηχητικό καθαριστικό

Αναμίκτης Vortex

Αναδευτήρας σταθερής θερμοκρασίας λουτρού νερού

Υψηλής ταχύτητας φυγοκεντρητής

2. Μέθοδος πειράματος

2.1 Προεπεξεργασία δείγματος

2.1.1 Ενζυμική υδρόλυση και εκχύλιση

Ζυγίστε 2g του δείγματος (με ακρίβεια ±0,05g) σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης 50mL. Προσθέστε 6mL διαλύματος ρυθμιστικού οξικού αμμωνίου 0,2mol/L και 40μL β-γλυκουρονιδάσης/αρυλοσουλφατάσης. Ανακατέψτε με vortex για να αναμειχθούν καλά και επωάστε στους 37°C στο σκοτάδι με ανακίνηση σε λουτρό νερού για 16 ώρες. Αφήστε να κρυώσει σε θερμοκρασία δωματίου για μεταγενέστερη χρήση.

2.1.2 Εκχύλιση, καθαρισμός και συγκέντρωση

Πάρτε το παρασκευασμένο διάλυμα, προσθέστε 100μL του πρότυπου διαλύματος εργασίας 100ng/mL, ανακατέψτε με vortex για να αναμειχθούν καλά και φυγοκεντρήστε στα 8000r/min για 8 λεπτά. Συλλέξτε το υπερκείμενο, προσθέστε 5mL διαλύματος υπερχλωρικού οξέος 0,1mol/L, ανακατέψτε με vortex για να αναμειχθούν και ρυθμίστε το pH σε 1,0 ± 0,2 χρησιμοποιώντας υπερχλωρικό οξύ. Μετά από φυγοκέντρηση στα 8000r/min για 8 λεπτά, ρυθμίστε το pH του υπερκείμενου σε 10 ± 0,5 χρησιμοποιώντας διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου 10mol/L. Προσθέστε 15mL οξικού αιθυλεστέρα, ανακινήστε με μέτρια ταχύτητα για 5 λεπτά και φυγοκεντρήστε στα 5000r/min για 5 λεπτά. Συλλέξτε το ανώτερο οργανικό στρώμα. Στο υπόλοιπο υδατικό στρώμα, προσθέστε 10mL tert-βουτυλομεθυλαιθέρα, ανακινήστε με μέτρια ταχύτητα για 5 λεπτά, φυγοκεντρήστε στα 5000r/min για 5 λεπτά και συλλέξτε το ανώτερο οργανικό στρώμα. Συνδυάστε όλα τα οργανικά στρώματα και εξατμίστε μέχρι να στεγνώσουν υπό ροή αζώτου στους 50°C. Διαλύστε το υπόλειμμα σε 5mL διαλύματος μυρμηκικού οξέος 2% και αφήστε το στην άκρη. Προετοιμάστε μια στήλη εκχύλισης στερεάς φάσης μικτής λειτουργίας κατ' επανάληψη ενεργοποιώντας την με 3mL μεθανόλης και 3mL μυρμηκικού οξέος 2%. Τοποθετήστε το παρασκευασμένο διάλυμα στη στήλη, ξεπλύνετε διαδοχικά με 3mL μυρμηκικού οξέος 2% και 3mL μεθανόλης και στεγνώστε υπό κενό. Εκλούστε τη στήλη με 3mL διαλύματος μεθανόλης 5% αμμωνίας. Εξατμίστε το εκλούσμα μέχρι να στεγνώσει υπό ροή αζώτου στους 50°C. Διαλύστε εκ νέου το υπόλειμμα σε 0,5mL διαλύματος μεθανόλης–0,1% μυρμηκικού οξέος (10:90, v/v), ανακατέψτε καλά και φιλτράρετε μέσω μιας μικροπορώδους μεμβράνης 0,22μm για ανάλυση με υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας ταντέμ.

2.2 Συνθήκες πειράματος

2.2.1 Συνθήκες υγρής χρωματογραφίας

Χρωματογραφική στήλη” C18, 1,8μm 2,1*100mm

Κινητή φάση : A : 0,1% Μυρμηκικό οξύ σε νερό; Β: Μεθανόλη

Ροή: 0,3 mL/min

Θερμοκρασία στήλης: 40°C

Όγκος έγχυσης: 3μL

3. Δοκιμή καταλληλότητας συστήματος

Η δοκιμή καταλληλότητας του συστήματος δείχνει ότι οι στοχευμένες κορυφές είναι καλοσχηματισμένες χωρίς παρεμβολές από άλλες κορυφές ακαθαρσιών, ικανοποιώντας τις πειραματικές απαιτήσεις.

Εικ. 1 Χρωματογράφημα επτά β-αγωνιστών (1ng/mL)

3.2 Γραμμικό εύρος

Λαμβάνοντας πρότυπα διαλύματα β-αγωνιστών και χρησιμοποιώντας διαλύματα εργασίας ενδιάμεσης συγκέντρωσης, παρασκευάστηκε μια τυπική καμπύλη σταδιακά. Το γραμμικό εύρος για τους επτά β-αγωνιστές ήταν 0,5–50ng/mL, με R² > 0,99, υποδεικνύοντας καλή γραμμική σχέση.

Πίνακας 3 Πίνακας γραμμικών εύρων για β-αγωνιστές

Εικ. 2 Χρωματογράφημα τυπικής καμπύλης επτά β-αγωνιστών

3.3 Όριο ανίχνευσης (LOD) και όριο ποσοτικοποίησης (LOQ)

Σε αυτή τη μέθοδο, το όριο ανίχνευσης (LOD) και το όριο ποσοτικοποίησης (LOQ) για τους β-αγωνιστές ορίζονται σε 0,2ng/mL και 0,5ng/mL, αντίστοιχα. Για κάθε ένωση σε αυτή τη μέθοδο, ο λόγος σήματος προς θόρυβο στις καθορισμένες συγκεντρώσεις για LOD και LOQ είναι μεγαλύτερος από 3 και 10, αντίστοιχα, ικανοποιώντας τις πειραματικές απαιτήσεις ευαισθησίας.

Πίνακας 4 Αντίστοιχοι λόγοι σήματος προς θόρυβο για LOD και LOQ κάθε ένωσης

Εικ. 3 Ιονικά χρωματογραφήματα επτά β-αγωνιστών σε συγκέντρωση LOD και LOQ

3.4 Δοκιμή ακρίβειας

Λήφθηκε ένα μείγμα διαλύματος τυπικών ουσιών β-αγωνιστών σε χαμηλές, μέσες και υψηλές συγκεντρώσεις και εγχύθηκε διαδοχικά έξι φορές για να συγκριθούν οι αποκλίσεις του χρόνου κατακράτησης και της περιοχής της κορυφής. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον παρακάτω πίνακα. Όλοι οι β-αγωνιστές έδειξαν αποκλίσεις χρόνου κατακράτησης μικρότερες από 1% και αποκλίσεις περιοχής κορυφής μικρότερες από 3%, ικανοποιώντας τις πειραματικές απαιτήσεις.

Πίνακας 5 Δοκιμή ακρίβειας για κάθε ένωση

Εικ. 4 Χρωματογραφήματα δοκιμών ακρίβειας επτά β-αγωνιστών (6 εγχύσεις)

3.5 Δοκιμή δείγματος

Τα δείγματα χοιρινού κρέατος που αγοράστηκαν από την αγορά ελέγχθηκαν σύμφωνα με την αναφερόμενη μέθοδο προεπεξεργασίας και δεν ανιχνεύθηκαν β-αγωνιστές. Δεν παρατηρήθηκαν χρωματογραφικές κορυφές στους χρόνους κατακράτησης που αντιστοιχούν στους επτά β-αγωνιστές, ενώ οι άλλες κορυφές αντιπροσωπεύουν τα σήματα της μήτρας μετά την ενζυμική υδρόλυση.

Εικ. 5 Χρωματογράφημα δοκιμής δείγματος χοιρινού κρέατος

4. Συμπέρασμα

Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί το σύστημα υγρής χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας ταντέμ Wayeal LCMS-TQ9200 για τον προσδιορισμό των β-αγωνιστών στο χοιρινό κρέας. Τα δεδομένα δείχνουν ότι όλες οι χρωματογραφικές κορυφές παρουσιάζουν καλό σχήμα χωρίς ουρά, η ευαισθησία ικανοποιεί τις πειραματικές απαιτήσεις, οι συντελεστές γραμμικής συσχέτισης υπερβαίνουν το 0,99 και η ακρίβεια είναι ικανοποιητική με αποκλίσεις χρόνου κατακράτησης κάτω από 1% και αποκλίσεις περιοχής κορυφής εντός 3% για έξι συνεχόμενες εγχύσεις κάθε ένωσης. Δεν ανιχνεύθηκαν β-αγωνιστές στις δοκιμές δειγμάτων χοιρινού κρέατος. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μέθοδος, εξοπλισμένη με το σύστημα Wayeal LC-MS/MS, εκπληρώνει τις απαιτήσεις ρουτίνας ποιοτικής και ποσοτικής ανίχνευσης για τις στοχευμένες αναλυτικές ουσίες.