62/2000 Προστατέψτε την υγεία των βρεφών και των μικρών παιδιών! Η χρωματογραφία ιόντων Wanyi προσδιορίζει επτά τύπους ανθρώπινου γάλακτος

Πρόλογος

Οι ολιγοσακχαρίτες του μητρικού γάλακτος (HMOs) είναι μια ομάδα ολιγοσακχαριτών με βαθμό πολυμερισμού όχι μεγαλύτερο από 3, που απαντώνται φυσικά στο μητρικό γάλα. Αποτελούν την τρίτη μεγαλύτερη στερεή συνιστώσα του μητρικού γάλακτος, μετά τη λακτόζη και το λίπος. Ρυθμίζουν την εντερική χλωρίδα – προάγοντας ιδιαίτερα τον αποικισμό των Bifidobacteriaceae στο έντερο του βρέφους – ενώ παράλληλα διατηρούν την εντερική υγεία, υποστηρίζουν την ανάπτυξη του ανοσοποιητικού και του εγκεφάλου, και ασκούν αντι-λοιμώδεις επιδράσεις, παίζοντας σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του βρέφους. Από την κυκλοφορία του πρώτου βρεφικού γάλακτος εμπλουτισμένου με HMOs στις Ηνωμένες Πολιτείες το 2015, έχουν πωληθεί παγκοσμίως μια ευρεία γκάμα βρεφικών γαλάτων, γαλακτοκομικών προϊόντων, συμπληρωμάτων για την υγεία του πεπτικού και λειτουργικών τροφίμων που περιέχουν HMOs. Από την 1η Ιουνίου 2023, οι ΗΠΑ και η ΕΕ έχουν εγκρίνει επτά HMOs για χρήση: 2'-φουκοζυλολακτόζη, 3'-φουκοζυλολακτόζη, διφουκοζυλολακτόζη, λακτο-Ν-νεοτετραόζη, λακτο-Ν-τετραόζη, 3'-σιαλυλολακτόζη και 6'-σιαλυλολακτόζη.

Μεταξύ των κοινών μεθόδων ανίχνευσης HMO, η υγρή χρωματογραφία απαιτεί αντίδραση παραγώγου πριν την ανίχνευση, περιλαμβάνει πολύπλοκη προετοιμασία δείγματος και τα αντιδραστήρια παραγώγου είναι συχνά τοξικά. Η ευαισθησία των HMOs στη θερμότητα οδηγεί επίσης σε χαμηλή απόκριση και κακή επαναληψιμότητα στην LC-MS. Αντίθετα, η ιοντική χρωματογραφία με αμπερομετρική ανίχνευση για υδατάνθρακες προσφέρει απλή προετοιμασία δείγματος, υψηλή απόκριση και καλή επαναληψιμότητα, δίνοντάς της σαφή πλεονεκτήματα για την ανάλυση HMO. Αυτή η σημείωση εφαρμογής χρησιμοποιεί χειροποίητα παρασκευασμένα διαλύματα υδροξειδίου του νατρίου, οξικού νατρίου και απιονισμένου νερού ως εκλουτές, και χρησιμοποιεί τον ιοντικό χρωματογράφο WAYEAL IC6300 για τον προσδιορισμό των HMOs σε βρεφικό γάλα. Η μέθοδος χαρακτηρίζεται από απλή προετοιμασία δείγματος, υψηλή ευαισθησία και καλή γραμμικότητα, παρέχοντας χρήσιμη αναφορά για την ανίχνευση HMO σε τρόφιμα.

Λέξεις-κλειδιά: ιοντικός χρωματογράφος· ολιγοσακχαρίτες μητρικού γάλακτος· αμπερομετρικός ανιχνευτής.

1. Όργανα, Εξοπλισμός και Αντιδραστήρια

1.1 Αντιδραστήρια και Πρότυπα

Πίνακας 1. Λίστα αντιδραστηρίων και προτύπων

1.2 Εργαστηριακά Υλικά και Βοηθητικός Εξοπλισμός

• 1.2.1 Αναλυτικός ζυγός (αναγνωσιμότητα 0,1 mg)·
• 1.2.2 Θερμοστατικό υδατόλουτρο·
• 1.2.3 Φυγοκεντρωτής·
• 1.2.4 Υδατικές μεμβράνες φίλτρου πολυαιθερσουλφονίου (PES) (0,45 μm)·
• 1.2.5 Απιονισμένο νερό·
• 1.2.6 Συσκευή φιλτραρίσματος κενού·
• 1.2.7 Στήλες προεπεξεργασίας εκχύλισης στερεάς φάσης (SPE) RP·
• 1.2.8 Σύριγγες μιας χρήσης (20 mL, 5 mL).

2. Πειραματική Μέθοδος

2.1 Παρασκευή Διαλυμάτων

• 2.1.1 Διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου 200 mmol/L: Πιπέτα 10,5 mL διαλύματος NaOH 50%, αραιώστε με νερό σε 1000 mL και φιλτράρετε υπό κενό.
• 2.1.2 Μικτό διάλυμα NaOH 75 mmol/L και οξικού νατρίου 250 mmol/L: Ζυγίστε με ακρίβεια 20,51 g οξικού νατρίου, διαλύστε σε νερό και μεταφέρετε σε ογκομετρική φιάλη 1000 mL· πιπετάρετε με ακρίβεια 3,95 mL διαλύματος NaOH 50%, αραιώστε σε 1000 mL με απιονισμένο νερό και φιλτράρετε υπό κενό.
• 2.1.3 Διάλυμα θειωσαλικυλικού οξέος 3%: Ζυγίστε 3,0 g θειωσαλικυλικού οξέος, διαλύστε σε νερό και αραιώστε σε 100 mL (παρασκευάστε φρέσκο).
• 2.1.4 Μικτό διάλυμα αρχικού προτύπου: Ζυγίστε με ακρίβεια 5 mg από κάθε ένα από τα 2'-φουκοζυλολακτόζη, 3'-φουκοζυλολακτόζη, 3'-σιαλυλολακτόζη, 6'-σιαλυλολακτόζη, λακτο-Ν-τετραόζη και λακτο-Ν-νεοτετραόζη (στο πλησιέστερο 0,1 mg), τοποθετήστε σε ογκομετρική φιάλη 10 mL, διαλύστε σε νερό και αραιώστε μέχρι τη χαραγή για να παρασκευαστεί αρχικό διάλυμα 500 mg/L. Ζυγίστε ξεχωριστά 1 mg διφουκοζυλολακτόζης (στο πλησιέστερο 0,1 mg), τοποθετήστε σε ογκομετρική φιάλη 10 mL, διαλύστε και αραιώστε μέχρι τη χαραγή για να παρασκευαστεί αρχικό διάλυμα 100 mg/L.
• 2.1.5 Μικτά διαλύματα εργασίας προτύπων: Πιπετάρετε με ακρίβεια το μικτό αρχικό διάλυμα (2.1.4) σε ογκομετρικές φιάλες και αραιώστε με νερό για να παρασκευαστούν μικτά διαλύματα εργασίας 2'-FL, 3'-FL, 3'-SL, 6'-SL, LNT, LNnT και DFL στις συγκεντρώσεις 0,5, 2, 4, 6, 8 και 10 mg/L. Παρασκευάστε φρέσκα πριν τη χρήση.

2.2 Προετοιμασία Δείγματος

Ζυγίστε περίπου 2,0 g δείγματος σε ένα μικρό ποτήρι ζέσεως, ανακατέψτε καλά με 50 mL ζεστό νερό (περίπου 50 °C), προσθέστε 40 mL διαλύματος θειωσαλικυλικού οξέος 3%, μεταφέρετε και αραιώστε σε 100 mL σε ογκομετρική φιάλη, και υπερηχογραφήστε για 10 λεπτά. Φιλτράρετε μέσω διηθητικού χαρτιού ή φυγοκεντρίστε (12.000 σ.α.λ., 15 λεπτά). Περάστε το διάλυμα του δείγματος μέσω στήλης SPE RP και στη συνέχεια μέσω υδατικής μεμβράνης φίλτρου 0,45 μm· απορρίψτε τα πρώτα 3 mL και συλλέξτε το εκλούμενο για ανάλυση. Πριν τη χρήση, προετοιμάστε τη στήλη SPE RP με 20 mL μεθανόλης ακολουθούμενη από 15 mL νερού, και εξισορροπήστε για 30 λεπτά.

2.3 Πειραματικές Συνθήκες

2.3.1 Συνθήκες ιοντικής χρωματογραφίας

3. Αποτελέσματα

3.1 Γραμμικό Εύρος

Αναλύθηκε κατάλληλο αλίκοτο από κάθε μικτό διάλυμα εργασίας προτύπου. Το γραμμικό εύρος ήταν 0,5-10 mg/L· οι αποκλίσεις μεταξύ των μετρούμενων και των ονομαστικών συγκεντρώσεων ήταν εντός της μέγιστης επιτρεπόμενης απόκλισης, οι τιμές R² ήταν άνω του 0,999, και όλα τα συστατικά έδειξαν καλή γραμμικότητα.

Πίνακας 2. Γραμμικά εύρη των ενώσεων

Σχήμα 1. Επικαλυπτόμενα χρωματογραφήματα βαθμονόμησης των επτά προτύπων HMO

3.2 Αποτελέσματα Δοκιμής Δείγματος

Τα δείγματα 1 και 2 δοκιμάστηκαν μετά από αραίωση 10 φορές. Η περιεκτικότητα καθενός από τα επτά HMO υπολογίστηκε ως εξής: X είναι η περιεκτικότητα στο δείγμα (mg/100g)· c είναι η συγκέντρωση στο διάλυμα του δείγματος από την καμπύλη βαθμονόμησης (mg/L)· V είναι ο σταθερός όγκος (mL)· m είναι η μάζα του δείγματος (g)· f είναι ο παράγοντας αραίωσης. Οι υπολογισμένες περιεκτικότητες (mg/100g) είναι οι εξής:

Σχήμα 2. Ιοντικό χρωματογράφημα του Δείγματος 1 αραιωμένου 10 φορές

Σχήμα 3. Ιοντικό χρωματογράφημα του Δείγματος 2 αραιωμένου 10 φορές

Πίνακας 3. Αποτελέσματα δοκιμής δείγματος

3.3 Ακρίβεια

Το διάλυμα εργασίας στο τέταρτο επίπεδο βαθμονόμησης αναλύθηκε σε έξι διαδοχικές εγχύσεις υπό τις συνθήκες του 2.3.1. Υπολογίστηκε το RSD των περιεκτικοτήτων των επτά HMO για την αξιολόγηση της επαναληψιμότητας. Τα παρακάτω αποτελέσματα υποδεικνύουν καλή ακρίβεια της μεθόδου.

3.3.1 Ακρίβεια Επαναληψιμότητας Προτύπου

Αποτελέσματα δοκιμής:

Σχήμα 4. Επικαλυπτόμενα χρωματογραφήματα ανεξάρτητων επαναλαμβανόμενων εγχύσεων του προτύπου βαθμονόμησης S4

Πίνακας 4. Ακρίβεια επαναληψιμότητας του προτύπου

3.4 Όρια Ανίχνευσης και Ποσοτικοποίησης

LOD: Αλίκοτα του διαλύματος προτύπου αραιώθηκαν σε ένα μικτό διάλυμα που περιείχε 10 μg/L 3'-FL, 30 μg/L DFL, 30 μg/L 2'-FL, 22 μg/L LNnT, 67 μg/L LNT, 67 μg/L 6'-SL και 160 μg/L 3'-SL· παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν 20 παράλληλα δείγματα.

LOQ: Αλίκοτα του διαλύματος προτύπου αραιώθηκαν σε ένα μικτό διάλυμα που περιείχε 30 μg/L 3'-FL, 80 μg/L DFL, 90 μg/L 2'-FL, 65 μg/L LNnT, 200 μg/L LNT, 200 μg/L 6'-SL και 500 μg/L 3'-SL· παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν έξι παράλληλα δείγματα.

Τα αποτελέσματα της δοκιμής είναι τα εξής:

Πίνακας 5. Αποτελέσματα S/N για LOD και LOQ των επτά HMO

3.5 Ειδικότητα

Προστέθηκαν αλίκοτα (100 μL το καθένα) διαλυμάτων προτύπων γλυκόζης, φρουκτόζης, σακχαρόζης και μαλτόζης σε ογκομετρική φιάλη 10 mL και αραιώθηκαν μέχρι τη χαραγή με διάλυμα Δείγματος 2 αραιωμένο 67 φορές. Το διάλυμα αναλύθηκε για να ελεγχθεί εάν αυτά τα σάκχαρα παρεμβάλλονταν στις κορυφές των επτά HMO. Όπως φαίνεται παρακάτω, τα τέσσερα σάκχαρα δεν έδειξαν σημαντική παρεμβολή στον προσδιορισμό των επτά HMO στο γάλα σε σκόνη.

Σχήμα 5. Επικαλυπτόμενα χρωματογραφήματα του προτύπου βαθμονόμησης S6, του Δείγματος 2 και του Δείγματος 2 με προσθήκη των τεσσάρων προτύπων σακχάρων

4. Συμπέρασμα

Αυτή η επικύρωση χρησιμοποίησε τον ιοντικό χρωματογράφο WAYEAL για την επαλήθευση της μεθόδου προσδιορισμού των HMO σε τρόφιμα. Τα δεδομένα δείχνουν ότι όλες οι χρωματογραφικές κορυφές έχουν καλό σχήμα χωρίς ουρές· οι 2'-FL, 3'-FL, DFL, LNnT, LNT, 6'-SL και 3'-SL εκλούονται εντός 60 λεπτών· η ευαισθησία πληροί τις απαιτήσεις των εθνικών προτύπων· και οι συντελεστές γραμμικής συσχέτισης είναι όλοι μεγαλύτεροι από 0,999. Η επαναληψιμότητα τόσο των προτύπων όσο και των δειγμάτων είναι καλή. Εκτός από τις δύο σιαλυλολακτόζες, το LOD και το LOQ είναι στο επίπεδο μg/L. Η μέθοδος έχει καλή ειδικότητα, χωρίς να βρεθούν παρεμβαλλόμενες ακαθαρσίες, και συνολικά πληροί τις απαιτήσεις του προτύπου.